Im
Vordergrund meines Forschungsinteresses steht die Untersuchung der
molekularen
Grundlagen der Morphogenese komplexer mehrzelliger Strukturen bei
Ascomyceten.
Diese bilden im Verlaufe ihrer sexuellen Fortpflanzung aus
verschiedenen
Zelltypen bestehende, komplexe räumliche Strukturen, die
sogenannten
Fruchtkörper, aus. Die mehrzelligen Fruchtkörper der
Ascomyceten dienen der
Ausbreitung und dem Schutz der meiotisch gebildeten Sporen.
Wie alle
eukaryotischen Entwicklungsprozesse, so ist auch die Ausbildung dieser
Fruchtkörper auf eine zeitlich und räumlich regulierte
Expression verschiedenster
Gene zurückzuführen. Die molekulargenetische Analyse der
Fruchtkörperentwicklung von Pilzen und die Isolierung der an
diesem Prozeß
beteiligten Gene kann dazu beitragen, detaillierte Erkenntnisse
darüber zu
gewinnen, wie formverändernde Entwicklungsprozesse bei
höheren Eukaryoten auf
molekularer Ebene reguliert werden. Meine Arbeiten gliedern sich in
vier
Schwerpunkte:
1.
Fruchtkörperentwicklung bei Pilzen
–
Komplementation von
Entwicklungsmutanten
Durch
molekulargenetische
Analysen von Entwicklungsmutanten, die Störungen in der
Fruchtkörpermorphogenese aufweisen, konnten durch unsere Arbeiten
in Bochum und
durch Kooperation mit Denise Zickler (Paris) bisher gänzlich
unbekannte
Entwicklungsgene isoliert werden (Masloff et al. 1999, Nowrousian et
al. 1999, van
Heemst et al. 1999, Pöggeler und Kück 2004). Zukünftig
möchte ich weitere
Entwicklungsmutanten des Hyphenpilzes Sordaria
macrospora mit molekular- und zellbiologischen Methoden analysieren
und so
zu einem komplexen molekularen Bild der pilzlichen Entwicklung
beitragen. Zurzeit
bearbeiten wir intensiv das Entwicklungsgen pro11, das ein
Protein mit
charakteristischen Protein-Protein Interaktionsdomänen kodiert. Das
PRO11 Polypeptid weist
eine signifikante Homologie zu der
in Säugern vorkommenden Protein-Familie der Striatine auf. Zur
Familie der
Striatine gehören das Striatin, S/G2NA („nuclear
autoantigen“),
und Zinedin. Es handelt sich bei diesen Proteinen um
membranassoziierte,
hauptsächlich in den Dendriten von Nervenzellen vorkommende
Proteine, die ein sogenanntes
„WD-repeat“ Motiv im C-Terminus und eine Ca2+/Calmodulin-Bindestelle
im N-Terminus aufweisen. Solche Motive findet man auch in dem von S.
macrospora kodierten Protein.
In
Kooperation mit der
Arbeitsgruppe von Prof. Kilimann (Ruhr-Universität Bochum) konnten
wir die cDNA
des Striatingens aus dem Maus-Hirn isolieren und zeigen, dass das
Säugerprotein
in der Lage ist, den Entwicklungsdefekt in S. macrospora zu
komplementieren (Pöggeler und Kück 2004). Da die Funktion des
Striatins vom
Pilz bis zum Säuger konserviert ist, stellt der Hyphenpilz S.
macrospora
ein ideales Modellsystem dar, um die Funktion von
Striatin-änhlichen Proteinen
bei Entwicklungsvorgängen von Neuronen molekulargenetisch
aufzuklären.
Gegenwärtig werden neue Interaktionspartner des PRO11 Proteins aus
S.
macrospora isoliert. Diese sollen in Zukunft charakterisiert werden.
2.
Analyse von Kreuzungstyp-Proteinen,
Pheromonen und Rezeptoren
Ein
weiterer Schwerpunkt meiner
Forschungsarbeiten ist es, die Funktionen der Kreuzungstyp-kodierten
Genprodukte von Hyphenpilzen aufzuklären. Die Kreuzungstyp-Gene
der Hyphenpilze
kodieren Proteine, von denen die meisten starke Ähnlichkeiten zu
DNA-bindenden
Transkriptionsfaktoren aufweisen. Die putativen Transkriptionsfaktoren
regulieren sehr wahrscheinlich essentielle zelluläre
Signalkaskaden, die zur
Befruchtung, Karyogamie und Meiose führen. Für die Karyogamie
und Meiose ist
bei Hyphenpilzen eine geordnete Verteilung der Kerne im
fruktifizierenden Myzel
die Voraussetzung. Neben ihrer wichtigen Rolle bei der Befruchtung
scheinen die
Kreuzungstyp-Produkte der filamentösen Ascomyceten in den
Kernerkennungs-Mechanismus einzugreifen, der für eine geordnete
Verteilung von
zwei Kernen während der Hakenbildung erforderlich ist. Die Rolle
der
Kreuzungstyp-Gene soll während der sexuellen Differenzierung mit
genetischen,
molekularbiologischen und zellbiologischen Methoden analysiert werden.
Putative
Zielgene von Kreuzungstyp-Proteinen aus filamentösen Ascomyceten
stellen
Pheromon- und Pheromon-Rezeptorgene dar. Solche Gene wurden von meiner
Arbeitsgruppe sowohl bei Neurospora crassa als auch bei Sordaria
macrospora identifiziert (Pöggeler 2000, Pöggeler und
Kück 2001). Die
Pheromon-Rezeptoren der filamentösen Ascomyceten sind
Membranproteine und
besitzen sieben Transmembran-Domänen. Sie ähneln stark den
G-Protein
gekoppelten Rezeptoren Ste3p und Ste2p der Bäckerhefe Saccharomyces
cerevisiae und
tierischen G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Wir analysieren das
Pheromon/Rezeptor-System aus S. macrospora sowohl heterolog in
der
Bäckerhefe als auch homolog in S. macrospora und planen
den
Signaltransduktionsweg vom Pheromon bis in den Zellkern funktionell zu
charakterisieren (Mayrhofer und Pöggeler 2005). Weiterhin
isolieren wir zurzeit Proteine, die mit Kreuzungstyp-Proteinen
interagieren
können, wie z. B. ein MCM1 homologes MADS-Box
Protein aus S. macrospora. Zukünftig wollen wir
klären, wie diese
Transkriptionsfaktoren die Aktivität von Pheromon- und
Rezeptorgenen
regulieren.
Ein
neuer Schwerpunkt meiner Arbeit liegt
in der funktionellen Analyse von Intein-tragenden Genen. Inteine sind
selbst-spleißende Protein-Sequenzen, die bei pathogenen Pilzen
attraktive Ziele
für pharmazeutische Substanzen darstellen. Wir haben bei
verschiedenen
Vertretern der Gattung Penicillium im
prp8-Gen, das für einen konservierten prä mRNA
Spleißfaktor kodiert,
Inteine entdeckt und versuchen die Evolution dieses genetischen
Elementes durch
Stammbaumanalysen klären. Außerdem wurde von meiner
Arbeitsgruppe die
Funktionalität dieser pilzlicher PRP8-Inteine durch heterologe
Expression in E.
coli aufgeklärt. Zukünftig soll das Spleißen von
PRP8-Inteinen sowohl in vitro als auch in
vivo analysiert werden.
4.
Evolution
von Entwicklungsgenen
Auf diesem Arbeitsgebiet nutzen wir Sequenzdaten und erstellen mit mathematischen Verfahren Stammbäume, durch die der Evolutionsverlauf des Fortpflanzungssystems von Hyphenpilzen rekonstruiert werden kann. In diesem Zusammenhang ist es uns gelungen in dem Genom des human-pathogenen Hyphenpilzes Aspergillus fumigatus die Kodierungskapazität für Pheromone, Rezeptoren und Kreuzungstyp-Proteine nachzuweisen, also Gene, die für eine sexuelle Fortpflanzung benötigt werden. Da bisher angenommen wurde, dass A. fumigatus sich ausschließlich asexuell fortpflanzt, ist es außerordentlich interessant zu untersuchen, ob die isolierten Gene in die Ausbildung der asexuellen Konidiosporen (diese stellen das pathogene Agens dar) involviert sind (Pöggeler 2002).
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